Projekta nosaukums: „Gripas vīrusa hemaglutinīna stalka peptīda diagnostiskais un imunoprotektīvais potenciāls: jaunu vakcīnu prototipu izstrāde”
Projekts tiek veikts Eiropas Reģionālā attīstības fonda (ERAF) 1.1.1.1. pasākuma “Praktiskas ievirzes pētījumi” 1. kārtas ietvaros.
Projekta identifikācijas Nr.: 1.1.1.1/16/A/054
Projekta izpildes termiņš: 2017. gada 1. aprīlis – 2020. gada 31. marts
Projekta kopējais finansējums: 648 643,69 EUR
Projekta zinātniskais vadītājs: Dr. biol. A. Kazāks
Universālas gripas vakcīnas trūkums ir globāla veselības aizsardzības problēma. Šobrīd īpašu interesi izraisa konservatīvi proteīnu domēni, kas varētu radīt aizsardzību vienlaicīgi pret dažādiem gripas vīrusiem. Viens no strukturāli konservatīvākajiem gripas vīrusa hemaglutinīna (HA) stalka rajoniem ir t.s. LAH (large antigenic helix) fragments. Mūsu līdzšinējie pētījumi ir parādījuši, ka šis 57 aminoskābju garais peptīds E. coli šūnās veido natīvam HA līdzīgu stabilu α-spirāļu trimēru. Pirmkārt, projekts paredz radīt principiāli atšķirīgu vakcīnas prototipu, eksponējot LAH trimēru tā natīvajā formā uz spēcīga imūnas atbildes potencētāja – VLP – virsmas. Tas ļaus saglabāt konformacionālos epitopus, kas nepieciešami vīrusneitralizējošo antivielu atpazīšanai. Tehniski to iespējams realizēt, ģenētiski sapludinot LAH peptīdu kodējošā gēnu ar T=3 simetrijas vīrusa apvalka proteīna gēnu. Līdzšinējie pētījumi vai nu izmantoja atsevišķi dažāda mākslīga HA peptīdu trimērus (veidojas pareizi konformacionālie epitopi, bet konstrukts nav pietiekami imunogēns), vai arī integrēja šos peptīdus VLP sastāvā kā monomērus (veidojas spēcīgi imunogēni, kas nesatur konformacionālos epitopus). Ar augstu varbūtību abu natīvo struktūru (LAH trimers + VLP) kombinācija ļaus konstruēt universālas gripas vakcīnas prototipu. Otrkārt, LAH trimēra attīrīšanas vieglums un efektivitāte padara to par pievilcīgu diagnostisku antigēnu. Tā kā parasti anti-HA stalka antivielas asinīs veidojas ļoti maz, tiks izstrādāta serodiagnostikas metode, lai identificētu cilvēku grupas ar paaugstinātu vīrusneitralizējošo antivielu titru.
Informācija publicēta 03.04.2017.
Projekta progress
2017. gada 1. aprīlis – 2017. gada 30. jūnijs
Projekts tiek realizēts saskaņā ar plānoto laika grafiku. Pirmkārt, ir izveidota virkne oriģinālu DNS konstruktu. Tie kodē gripas vīrusa hemaglutinīna stalka LAH domēnu, kas ģenētiski sapludināts ar dažādu RNS fāgu apvalka proteīnu gēniem, tos atdalot ar kustīgu linkersekvenci. Himēro gēnu ekspresijā E.coli šūnās tika novērots augsts sintēzes līmenis. Lai gan lielākā daļa mērķa proteīnu atradās šūnu nogulsnēs un neizraisa praktisku interesi, tomēr daži ir daļēji šķīstoši. Tie kalpos par pamatu turpmākajai konstruktu optimizācijai.
Otrkārt, tika konstruēts vektors LAH3 gēna ekspresijai. Sākotnēji mērķa proteīna produkcija netika novērota, taču pēc kodonu optimizācijas izdevās iegūt pietiekami augstu sintēzes līmeni. Tika izstrādāta LAH3 attīrīšanas metodika. Tāpat kā LAH1, arī šis proteīns veido trimēru, taču attīrīšanas procesā ir vairākas atšķirības. Tika atstrādāti LAH1 un LAH3 trimēru ilgstošas uzglabāšanas apstākļi pie -20°C. Iegūtie proteīni kalpos par pamatu strukturāliem pētījumiem kā arī imunoloģisku testu izstrādei.
Informācija publicēta 30.06.2017.
Projekta progress
2017. gada 1. jūlijs – 2017. gada 30. septembris
Projekts tiek realizēts saskaņā ar plānoto laika grafiku. Šobrīd darbs norisinās paralēli visu četru darba pakešu (WP) ietvaros.
WP1 noslēgusies aktivitāte 1.1, kur tika izveidota virkne himēru LAH-CP DNS konstruktu. No četriem fāgu strukturālajiem proteīniem tika atlasīti divi perspektīvākie, kuri kalpo par pamatu turpmākajai konstruktu optimizācijai. Aktivitātes 1.2 ietvaros uz fāgu PP7 un AP205 CP bāzes tiek testētas dažādas linkersekvences, kas atdala LAH domēnu no fāgu CP daļas. Izveidotās konstrukcijas tiek salīdzinoši ekspresētas un pētīta to šķīdība kā arī VLP veidotspēja.
WP2 noslēgusies aktivitāte 2.1, kur tika izstrādāta un uzlabota LAH1 un LAH3 trimēru attīrīšanas metodika. Attīrītie trimēri tiks izmantoti imunoloģisku testu izstrādei peļu un cilvēku modeļsistēmās aktivitāšu 2.2 un 2.3 ietvaros. Saskaņā ar plānoto, šīs aktivitātes tiks realizētas ar ārpakalpojuma palīdzību, un šobrīd tiek veikta attiecīgā iepirkuma procedūra.
WP3 aizsākta LAH trimēru kristālstruktūras noteikšana, un jau iegūti pirmie kristāli zema pH apstākļos. Pirmie struktūras dati gaidāmi š.g. beigās.
WP4 aizsākta aktivitāte 4.1. Ar attīrītajiem LAH trimēriem ir imunizētas peles, lai izolētu B-šūnas LAH specifisku antivielu pētījumiem turpmāko aktivitāšu 4.2 un 4.3 ietvaros.
Informācija publicēta 29.09.2017.
Projekta progress
2017. gada 1. oktobris – 2017. gada 31. decembris
Projekts tiek realizēts saskaņā ar plānoto laika grafiku. Šobrīd darbs norisinās paralēli visu četru darba pakešu (WP) ietvaros.
WP1. Aktivitātes 1.2 ietvaros uz fāgu PP7 un AP205 CP bāzes tika testētas dažādas linkersekvences, kas atdala LAH domēnu no fāgu CP daļas. Tika izveidota virkne jaunu konstruktu, kuriem pētīta šķīdība kā arī VLP veidotspēja. Izrādījās, ka linkersekvences izvēle būtiski ietekmē himērā proteīna šķīdību, taču VLP veidošanās pagaidām nav konstatēta. Tādejādi paralēli esošo konstruktu optimizācijai tiek plānota vēl citu nesējproteīnu testēšana LAH trimēru eksponēšanai.
WP2. Attīrītie LAH trimēri šobrīd tiek izmantoti kā antigēni imunoloģisku testu izstrādei peļu un cilvēku modeļsistēmās aktivitāšu 2.2 un 2.3 ietvaros. Saskaņā ar plānoto, šīs aktivitātes tiek realizētas ar ārpakalpojuma palīdzību, ko nodrošina firma iQur Anglijā.
WP3. LAH trimēru kristālstruktūras izpētei tika iegūti proteīnu kristāli dažādos buferšķīdumos skāba pH apstākļos. Sinhrotronā jau ir uzņemti pirmie rentgenstaru difrakcijas spektri, kas kalpos par pamatu turpmākajai struktūras noteikšanai.
WP4. Aktivitātes 4.1 ietvaros ar attīrītajiem LAH trimēriem tika imunizētas peles un no liesas ar FACS palīdzību izolētas atsevišķas LAH specifiskas B-šūnas. No šīm šūnām ar PCR tiks amplificēti, klonēti un sekvenēti gēni, kas atbild par antivielu variablo rajonu sintēzi.
Informācija publicēta 02.01.2018.
Projekta progress:
2018. gada 1. janvāris – 2018. gada 31. marts
WP1. Aktivitātes 1.2 ietvaros turpinās mēģinājumi LAH trimēru eksponēšanai uz fāga PP7 VLP virsmas, jo no testētajiem RNS fāgiem tas atzīts par perspektīvāko kandidātu. Paralēli esošo konstruktu optimizācijai tiek testēti arī citi nesējproteīni, piemēram, ferritīna nanodaļiņas, hepatīta B vīrusa kor-antigēns u.c.
WP2. Attīrītie LAH trimēri tiek izmantoti kā antigēni imunoloģiskiem ELISA testiem, kurus ar ārpakalpojuma palīdzību realizē firma iQur Anglijā. Aktivitātes 2.2 ietvaros ir izstrādāta anti-stalka antivielu detekcijas metode peļu asins serumos. Aktivitātes 2.3 ietvaros šobrīd tiek izstrādāta analoģiska metode cilvēku asins serumos.
WP3. Turpinās datu apstrāde LAH trimēru trīsdimensionālās struktūras iegūšanai. Iegūtie primārie rezultāti liecina, ka trimēri zema pH apstākļos ieņem konformāciju, kas atbilst hemaglutinīna post-fusion formai.
WP4. No izdalītajām LAH specifiskajām B-šūnām ar RT-PCR šobrīd tiek amplificēti un sekvenēti gēni, kas atbild par antivielu variablo rajonu sintēzi.
Informācija publicēta 29.03.2018.
Projekta progress:
2018. gada 1. aprīlis – 2018. gada 30. jūnijs
Projekts tiek realizēts saskaņā ar laika grafiku visu četru darba pakešu (WP) ietvaros.
WP1. Aktivitātē 1.2 turpinās mēģinājumi LAH trimēru inkorporēšanai vīrusveidīgu daļiņu sastāvā. Iegūtie dati liecina, ka šādas himēras daļiņas var iegūt uz hepatīta B vīrusa kor-antigēna bāzes.
WP2. Aktivitātē 2.3 tiek izstrādāta anti-stalka antivielu ELISA detekcijas metode cilvēku asins serumos, ko ārpakalpojuma ietvaros realizē firma iQur Anglijā.
WP3. Turpinās datu apstrāde LAH trimēru trīsdimensionālās struktūras iegūšanai. Iegūtie rezultāti apstiprina, ka trimēri zema pH apstākļos ieņem konformāciju, kas atbilst hemaglutinīna post-fusion formai.
WP4. No LAH specifiskajām B-šūnām ir amplificēti un nosekvenēti vairāki antivielu smago un vieglo ķēžu variablie rajoni, kas kalpos par pamatu turpmākajiem pētījumiem aktivitātes 4.2 ietvaros.
Informācija publicēta 29.06.2018.
Projekta progress:
2018. gada 1. jūlijs – 2018. gada 30. septembris
Projekts tiek realizēts saskaņā ar laika grafiku visu četru darba pakešu (WP) ietvaros.
WP1. Noslēgusies aktivitāte 1.2, kur LAH trimēri ir veiksmīgi inkorporēti hepatīta B vīrusa kor-antigēna vīrusveidīgo daļiņu sastāvā. Attiecīgo himēro VLP attīrīšanas optimizācija turpināsies aktivitātē 1.3.
WP2. Aktivitātē 2.3 tiek izstrādāta anti-stalka antivielu ELISA detekcijas metode cilvēku asins serumos, ko ārpakalpojuma ietvaros realizē firma iQur Anglijā.
WP3. Noslēgusies datu apstrāde LAH trimēru trīsdimensionālās struktūras iegūšanai. Iegūtie rezultāti apstiprina, ka trimēri veido konformāciju, kas atbilst hemaglutinīna post-fusion formai zema pH vidē. Izveidotais struktūras fails deponēts PDB datubāzē ar pieejas kodu 6GOL.
WP4. Aktivitātes 4.2 ietvaros no LAH specifiskajām B-šūnām amplificētie antivielu smago un vieglo ķēžu variablie rajoni tiek klonēti ekspresijas vektorā pVITRO-IgG1/κ attiecīgo antivielu sintēzei zīdītāju šūnās.
Informācija publicēta 28.09.2018.
Projekta progress:
2018. gada 1. oktobris – 2018. gada 31. decembris
WP1 aktivitātē 1.3 turpinās LAH trimērus saturošo himēro VLP attīrīšanas optimizācija.
Noslēgusies WP2, kur aktivitātes 2.3 ietvaros izstrādāta anti-stalka antivielu ELISA detekcijas metode cilvēku asins serumos, ko ārpakalpojuma ietvaros realizēja firma iQur Anglijā.
Noslēgusies WP3, kur iegūta LAH trimēru trīsdimensionālā struktūra, kas deponēta PDB datubāzē ar pieejas kodu 6GOL kā arī detalizēti aprakstīta zinātniskā publikācijā.
WP4 aktivitātes 4.2 ietvaros izveidotas DNS konstrukcijas LAH specifisko antivielu iegūšanai. Šobrīd notiek attiecīgo konstruktu ekspresija zīdītāju šūnās.
Informācija publicēta 28.12.2018.
Projekta progress
2019. gada 1. janvāris – 2019. gada 31. marts
Noslēgusies WP1 aktivitāte 1.3, kur attīrītas LAH trimērus saturošas himēras VLPs, kas kalpos par vakcīnas prototipa kandidātiem. Aktivitātē 1.4 aizsākta attiecīgo VLP antigenitātes un imunogenitātes pārbaude peļu modelī. Šo pārbaudi ārpakalpojuma ietvaros veic Eksperimentālās medicīnas institūts Sanktpēterburgā, Krievijā.
Noslēgusies WP4 aktivitāte 4.2. Šajā aktivitātē zīdītāju suspensijas šūnu kultūrā tika sekretori ekspresētas LAH specifiskas antivielas. Tika atstrādāta attiecīgo antivielu attīrīšanas metode ar afinitātes hromatogrāfiju. Aizsākta attīrīto antivielu funkcionāla raksturošana.
Informācija publicēta 29.03.2019.
Projekta progress
2019. gada 1. aprīlis – 2019. gada 30. jūnijs
Aktivitātē 1.4 norisinās atlasīto himēro VLP vakcīnas prototipu antigenitātes un imunogenitātes pārbaude peļu modelī. Šo pārbaudi ārpakalpojuma ietvaros veic Eksperimentālās medicīnas institūts Sanktpēterburgā, Krievijā. Noslēdzies primārais VLP protekcijas tests, kas ļāva izvēlēties visperspektīvāko vakcīnas kandidātu. Šobrīd norisinās sekundārais protekcijas tests ar dažādu subtipu gripas vīrusiem.
Zīdītāju suspensijas šūnu kultūrā ekspresētās LAH specifiskās antivielas tika attīrītas ar afinitātes hromatogrāfiju. Aizsākta iegūto antivielu funkcionāla raksturošana ar ELISA testiem, kā antigēnus izmantojot dažādus LAH saturošus rekombinantus proteīnus.
Informācija publicēta 28.06.2019.
Projekta progress
2019. gada 1. jūlijs – 2019. gada 30. septembris
Aktivitātē 1.4 norisinās atlasīto himēro VLP vakcīnas prototipu antigenitātes un imunogenitātes pārbaude peļu modelī. Šo pārbaudi ārpakalpojuma ietvaros veic Eksperimentālās medicīnas institūts Sanktpēterburgā, Krievijā. Noslēdzies sekundārais VLP protekcijas tests ar dažādu subtipu gripas vīrusiem, kurā tika raksturots perspektīvākā vakcīnas kandidāta imunoprotektīvais potenciāls. Šobrīd aizsākta aktivitāte 1.5, kurā vakcīnas kandidātu raksturos ar T-šūnu aktivitātes testiem, kas noslēgs projekta eksperimentālo daļu.
Turpinās iegūto LAH specifisko antivielu funkcionāla raksturošana ar ELISA testiem, kā antigēnus izmantojot dažādus LAH saturošus rekombinantus proteīnus un himēras VLPs.
Informācija publicēta 30.09.2019.
Projekta progress
2019. gada 1. oktobris – 2019. gada 31. decembris
Noslēgušās aktivitātes 1.4 un 1.5, kur tika veikta atlasīto himēro VLP vakcīnas prototipu pārbaude peļu modelī. Šo pārbaudi ārpakalpojuma ietvaros veica Eksperimentālās medicīnas institūts Sanktpēterburgā, Krievijā. Līdz ar to noslēgusies projekta eksperimentālā daļa, kurā tika raksturots perspektīvākā vakcīnas kandidāta imunoprotektīvais potenciāls. Šobrīd aizsākta iegūto datu apkopošana un apstrāde publicēšanai.
Aktivitātē 4.3 noslēgusies iegūto LAH specifisko antivielu funkcionāla raksturošana ar ELISA testiem, kā antigēnus izmantojot dažādus LAH saturošus rekombinantus proteīnus un himēras VLPs. Tika konstatēts, ka iegūtās antivielas ir subtipu specifiskas kā arī tās ērti izmantot LAH sekvenču lokalizēšanai VLP sastāvā.
Informācija publicēta 30.12.2019.
Projekta progress
2020. gada 1. janvāris – 2020. gada 31. marts
Šajā laikā tika realizēta projekta noslēdzošā aktivitāte 1.6, kas tika veltīta aktivitātēs 1.3-1.5 iegūto datu apkopošanai un sagatavošanai publicēšanai. Tika iegūti augstas kvalitātes rezultāti, kas apliecina izvēlētā vakcīnas prototipa imunoprotektīvo potenciālu. Projekta gaitā tika izstrādāta jauna metode himēro VLP iegūšanai, kur tika kombinēta ģenētiskā sapludināšana ar ķīmisko piesaisti. Tas ļauj vienā daļiņā iekļaut vienlaicīgi vairākus antigēnus. Manuskripts sagatavots iesniegšanai žurnālā Vaccines.
Informācija publicēta 31.03.2020.