Jauna tipa terapeitisko anti-HCV individualizēto vakcīnu prototipu izstrādāšana.
Projekts tiek īstenots ERAF 2.1.1.1. aktivitātes „Atbalsts zinātnei un pētniecībai” ietvaros
Projekta vienošanās Nr. 2010/0224/2DP/2.1.1.1.0/10/APIA/VIAA/164
Projekta izpildes termiņš: 36 mēneši (01.10.2010.-30.09.2013.)
Projekta kopējais finansējums: 266419 LVL
Projekta zinātniskais vadītājs: Dr. biol. Irina Sominska
Kā sadarbības partneris – Valsts aģentūra “Latvijas Infektoloģijas centrs”
Projekta vispārīgais mērķis – HCV hronisko pacientu ārstēšanas efektivitātes paaugstināšana.
Projekta specifiskais mērķis – jauna tipa individuālo terapeitisko vakcīnu prototipu izstrāde un universālas laboratorijas tehnoloģijas izstrāde šādā tipa vakcīnas ražošanai.
Mūsu projekts paredz anti-HCV individuālas terapeitiskas vakcīnas prototipa izstrādi. Idejas pamatā ir vīrusa strukturālās daļas mainīgo un nestrukturālās daļas konservatīvo rajonu kombinācija. Šāda tipa vakcīna varētu būt efektīva hroniskas infekcijas gadījumā.
Vakcīnas prototipa proteīna daļa sastāv no vīrusa apvalkproteīna E2 augsti mainīgās daļas (hipervariablais reģions, HVR1). HVR1 sekvence tiks izvēlēta individuāli, izmantojot attiecīgā pacienta serumā esošo HCV genoma materiālu.
Vakcīnas protoptipa DNS komponentei tiks izmantotas augsti konservatīvo nestrukturālo proteīnu NS3/4a CTL un T-helperu epitopus. Kā alternatīvs variants var tikt izmantota plazmīda, kas satur pilnu NS3/4a proteīnus kodējošu sekvenci. NS3/4a sekvence tiks konstruēta pēc konsensus principa, kombinējot Latvijā izplatītāko 1b subtipa HCV izolātu sekvences.
Tieši HVR1 rajona augstā mainība, no mūsu viedokļa, rada nepieciešamību veidot personalizētās jeb individuālās vakcīnas, kas būtu efektīgas pret konkrētā slimnieka hepatīta C vīrusu. Nosakot šī konkrētā vīrusa attiecīgo HVR1 rajona sekvenci, var veidot vakcīnu modeļus, kuros paredzēta šīs sekvences ekspresija un spēja izsaukt konkrēto vīrusu neitralizējošu antivielu veidošanos. Pētījumos ar šimpanzēm tika parādīts, ka HVR1 rajons satur vīrusu neitralizējošus epitopus (17-22). Nesen tika demonstrēta saistība starp akūtās virēmijas samazināšanos un HCV pseidovīrusus neitralizējošu antivielu līmeni (23,24). Retos gadījumos spontāna hroniskās infekcijas pārvarēšana ir saistīta ar augstiem anti-E2 antivielu titriem, kuras spēj bloķēt vīrusa mijiedarbību ar svarīgu receptora komponenti (25; 26). Antivielu aizsarglomu apstiprina fakts, ka ievērojami smagāka slimības hroniskā gaita tiek novērota hipogammaglobulinēmijas pacientiem (25, 27). Šimpanzu inficēšanos ar HCV ir izdevies pilnīgi novērst, ievadot tām pēc inokulācijas trušu anti-HCV antiserumus (21; 28).
NS3/4a proteīnam, vienam no konservatīvākajiem dažādos HCV genotipos, piemīt serīna proteāzes un helikāzes aktivitāte (29). Proteīna NS3 rajons satur CD4+ T-helperu epitopus un vairākus CTL epitopus. Šūnu imūnā atbildes pret NS3/4a proteīnu ātrums un intensitāte nosaka organisma atbrīvošanas no HCV infekcijas (30, 31). Līdz ar to, NS3/4a var kalpot kā būtiska HCV vakcīnas kandidāta komponente. Nesen DNS vakcīnas veidā ir tikusi demonstrēta NS3/4a augstā imunogenitāte kā pelēs, tā arī ar HCV inficētajos cilvēkos (32).
Kā vispiemērotāko VLP vektoru, mēs plānojam izmantot rekombinanto HBc, kurš tiek ekspresēts E.coli sistēmā un spēj tajā veidot VLP ar augstu efektivitāti (8). Uz šo VLP bāzes šajā projektā tiks veidotas himerās HVR1 saturošas rekombinanto proteīnu konstrukcijas, kas nodrošinās tajās ieslēgto heterologo proteīnu fragmentu imunogentitāti, pateicoties VLP molekulārajai organizācijai un tām piemītošai augstai imunogenitātei per se. Rekombinantais HBc kā heterologu sekvenču nesējproteīns, efektīvi aktivē T-helperiem 1 līdzīgo a-IFN atbildi (33). Izmantojot BMC Proteīnu inženierijas pieredzi himēro VLP konstruēšanā, ir iespējams konstruēt universālu vektoru kopu, kas ļaus veikt vakcīnu modeļu dizainu un prototipu izstrādni, rekombinanto VLP sastāvā ieslēdzot noteiktu proteīnu izvēlētās mērķsekvences tādā veidā, lai netraucētu nesējproteīna HBc pašsavākšanās spēju.
CTL atbildes aktivācijai visefektīvākā ir ģenētiskā imunizācija ar DNS, kur ir iekļauts HBc gēns (34). NS3/4a epitopus ir paredzēts klonēt HBc gēna 3’galā.
Būtiski ir arī tas, ka mums ir iespējas veikt pilnu pētījumu ciklu, kas ietver vakcīnu kandidātu dizainu, modelēšanu, variantu konstruēšanu un to strukturāli funkcionālu izpēti. Tehnoloģijas izstrādne paredz himēro VLP ekspresijas optimizāciju, to iegūšanas cikla izveidošanu, izmantojot pašas jaunākās proteīnu attīrīšanas metodes. Laboratorijas aprīkojums pilnībā nodrošina GLP (good laboratory practice) apstākļus.
Atskaites
Līdz 2012. gada 30. jūnijam:
1.1 Proteīnu un DNS vakcīnu komponentu iegūšana un raksturošana.
Tika turpināta perspektīvo rekombinanto konstrukciju uz modificēta cilvēka hepatīta B vīrusa kora antigēna (HBc) platformas izveidošana un izvērtēšana proteīnu vakcīnu komponentu iegūšanai. Divas HCV NS3 1435-1446 CTL epitopu saturošas rekombinantas konstrukcijas uz wild type un modificēta pilna garuma HBc bāzes tika ekspresētas E.coli šūnas. Abos gadījumos tika konstatētas VLP veidošanas. Konstrukcijai uz modificēta HBc bāzes ir ekspresijas līmenis, toties konstrukcija uz wild type HBc veido VLP efektīvāk. Ekspresijas optimizācijas rezultātā tika iegūta E.coli biomasa ar augsto rekombinanto proteīnu saturu. Pielietojot dažādas bioķīmijas un fizikālas ķīmijas metodes tika izveidotas rekombinanto proteīnu attīrīšanas un glabāšanas shēmas, kas ļauj iegūt lielo daudzumu augstas tīrības pakāpes vīrusveidīgas daļiņas. Pielietojot tās shēmas tika iegūti HCV NS3 1435-1446 CTL epitopu saturošie rekombinantie proteīni imunizācijas eksperimentiem nepieciešamā kvalitātē un daudzumā.
1.2. Dzīvnieku imunizācija.
Tika turpināti laboratoriju dzīvnieku imunizācijas eksperimenti izmantojot himeras vīrusveidīgas daļiņas. No Balb/c līnijas pelēm, kas tika imunizētas ar dažādiem HBc/HVR1 rekombinānto proteīnu variantiem, pēc starpposma pārbaudes rezultatīviem tika atlasīti eksemplāri ar augsto imūnas atbildes līmeni. No viņiem tika savākts asins serums ar pietiekoši auksto anti-HVR antivielu titru.
1.3. B- un T- šūnu imūnā atbilde.
Tika uzsākta ar HBc/HVR1 rekombinānto proteīnu imunizeto peļu asins serumu pārbaude HCV pseudotyping neitralizācijas eksperimentos. Provizoriskie dati liecina, ka imunizēto dzīvnieku serums satur HCV neitralizējušas antivielas.
Līdz 30.09.2012.
1.1 Proteīnu un DNS vakcīnu komponentu iegūšana un raksturošana.
Tika turpināta perspektīvo rekombinanto konstrukciju uz modificēta cilvēka hepatīta B vīrusa kora antigēna (HBc) platformas izveidošana un izvērtēšana proteīnu vakcīnu komponentu iegūšanai. Tika veikts mēģināmus uzkonstruēt multiepitopu vakcīnas prototipu. Tika sintezētas rekombinantas konstrukcijas uz HBc bāzes, kas satur gan HCV HVRI sekvenci HBc proteīna C-galā, gan HBV preS1 sekvenci HBc proteīna MIR reģionā.Ekspresijas optimizācijas rezultātā tika iegūta E.coli biomasa ar augsto rekombinanto proteīnu saturu. Pielietojot dažādas bioķīmijas un fizikālas ķīmijas metodes tika izveidotas rekombinanto proteīnu attīrīšanas un glabāšanas shēmas, kas ļauj iegūt lielo daudzumu augstas tīrības pakāpes vīrusveidīgas daļiņas. Pielietojot tās shēmas tika iegūti HCV HVRI un HBV preS1 CTL epitopu saturošie rekombinantie proteīni imunizācijas eksperimentiem nepieciešamā kvalitātē un daudzumā.
1.2. Dzīvnieku imunizācija.
Tika turpināti laboratoriju dzīvnieku imunizācijas eksperimenti izmantojot himeras vīrusveidīgas daļiņas. Balb/c līnijas pelēs tika imunizētas ar vīrusveidīgām daļiņām, kas satur jaunās no Latvijas HCV pacientiem iegūtās HVRI sekvences.
1.3. B- un T- šūnu imūnā atbilde.
Tika turpināta HBc/HVR1 rekombinānto proteīnu imunizeto peļu asins serumu pārbaude HCV pseudotyping neitralizācijas eksperimentos. Tika konstatēts, kā HCV neitralizējušām antivielām serumā piemīt gan augsti specifiskā aktivitāte pret unikālām HVRI sekvencēm, gan spējas reaģēt ar atšķirīgām tā paša genotipa un pat citu genotipu HVRI sekvencēm.
Līdz 31.12.2012.
1.1 Proteīnu un DNS vakcīnu komponentu iegūšana un raksturošana.
Tika turpināta perspektīvo rekombinanto konstrukciju uz modificēta cilvēka hepatīta B vīrusa kora antigēna (HBc) platformas izveidošana un izvērtēšana proteīnu vakcīnu komponentu iegūšanai.
Tika sintezētas rekombinantas konstrukcijas uz HBc bāzes, kas satur HCV genoma NS3 reģiona 222-251as, 327-394 as un 397-462 as fragmentus ar teorētiski augstu CTL imūnas atbildes izraisīšanas potenciālu.
Ekspresijas optimizācijas rezultātā tika iegūta E.coli biomasa ar augsto rekombinanto proteīnu saturu. Pielietojot dažādas bioķīmijas un fizikālas ķīmijas metodes tika izveidotas rekombinanto proteīnu attīrīšanas un glabāšanas shēmas, kas ļauj iegūt lielo daudzumu augstas tīrības pakāpes vīrusveidīgas daļiņas. Pielietojot tās shēmas tika iegūti HCV NS3 CTL epitopu saturošie rekombinantie proteīni imunizācijas eksperimentiem nepieciešamā kvalitātē un daudzumā.
1.2. Dzīvnieku imunizācija.
HBc176/NS3 222-251, HBc176/NS3 327-394, HBc176/NS3 397-462 himērās vīrusveidīgās daļiņas (VLP) ar iepakotajiem CpG oligonukleotīdiem tika izmantotas C57BL/6 peļu imunizācijai. Lai paaugstinātu imūno atbildi uz HCV NS3 epitopiem, ko satur vīrusveidīgās daļiņas, imunizācijai tika izmantots AS03 adjuvants (GlaxoSmithKline). Katrā grupā tika izmantoti seši dzīvnieki. Peles tika imunizētas ar 20 µg proteīna intramuskulāri vienu reizi. Septītajā dienā pēc imunizācijas no dzīvnieku liesām tika iegūti splenocīti, kuri tika kultivēti HCV NS3 peptīdu klātbūtnē 7 dienas. Pēc restimulācijas, splenocīti tika apstrādāti ar fluoroforu konjugētajām anti-CD4, anti-CD8 un anti-INF-γ antivielām.
Dzīvnieku modelis un imunizācijas shēma tika piemeklēti optimālas T šūnu atbildes iegūšanai. Pētījumā iegūto himēro proteīnu imunogenitātes salīdzināšanai, peles tika imunizētas gan ar CpG saturošajām himērajām VLP, gan ar natīvajām VLP, kas satur nespecifisku nukleīnskābi (pārsvarā RNS) no E.coli.
1.3. B- un T- šūnu imūnā atbilde.
Ar anti-CD4, anti-CD8 un anti-INF-γ antivielām iezīmētās peļu šūnas tika analizētas uz FACS Aria II plūsmas citometra sortera. Tika noteiktas sekojošas šūnu populācijas: INF-γ producējošas CD4+ (T helperu) šūnas un INF-γ producējošas CD8+ (citotoksiskie limfocīti (CTL)) šūnas. Rezultāti parādīja, ka HBc176/NS3 222-251 konstrukcijas gadījumā CpG saturošās VLP inducēja spēcīgāku un plašāku T helperu imūno atbildi (līdz pat 12% atsevišķos dzīvniekos uz diviem NS3 peptīdiem). CTL atbilde šajā gadījumā bija līdzvērtīga un tikai nedaudz virs fona.
HBc176/NS3 327-394 konstrukcija nespēja inducēt ievērojamu T helperu vai CTL atbildi, kas varētu liecināt par to, ka šajā konstrukcijā nav peļu imunodominanto epitopu vai arī šī NS3 fragmenta iekļaušana HBc sastāvā mainīja epitopu atpazīšanas spēju.
HBc176/NS3 397-462 konstrukcijas gadījumā ar CpG saturošo VLP izmantošanu tika panākta plašāka T helperu (INF-γ produkcija uz vairākiem NS3 peptīdiem) imūnatbilde un stipra CTL atbilde, kas natīvo VLP gadījumā bija tikai fona līmenī.
Līdz 31.03.2013.
1.1 Proteīnu un DNS vakcīnu komponentu iegūšana un raksturošana.
Tika turpināta perspektīvo rekombinanto konstrukciju uz modificēta cilvēka hepatīta B vīrusa kora antigēna (HBc) platformas izveidošana un izvērtēšana proteīnu vakcīnu komponentu iegūšanai.
Ekspresija HCV NS3 1435-1446 as CTL saturošo rekombinanto proteīnu uz dabīgā un modificētā HBcAg bāzes tika optimizēta, tika konstatētas vīrusveidīgo daļiņu veidošanas. Pielietojot dažādas bioķīmijas un fizikālas ķīmijas metodes tika izveidotas rekombinanto proteīnu attīrīšanas un glabāšanas shēmas, kas ļauj iegūt lielo daudzumu augstas tīrības pakāpes HBc/NS3 vīrusveidīgas daļiņas. Pielietojot tās shēmas tika iegūti NS3 CTL epitopu sekvenču saturošie rekombinantie proteīni imunizācijas eksperimentiem nepieciešamā kvalitātē un daudzumā.
1.2. Dzīvnieku imunizācija.
HCV NS3 1435-1446 as CTL saturošas himēras VLD uz dabīgā un modificētā HBcAg bāzes tika izmantotas C57BL/6 peļu imunizācijai. Dzīvnieku modelis un imunizācijas shēma tika piemeklēti optimālas T šūnu atbildes iegūšanai. Pētījumā iegūto himēro proteīnu imunogenitātes salīdzināšanai, peles tika imunizētas gan ar natīvajām VLD, kas satur nespecifisku nukleīnskābi (pārsvarā RNS) no E.coli, gan ar modificētām VLD, kas nukleīnskābi nesatur.
Līdz 30.06.2013.
1.3. B- un T- šūnu imūnā atbilde.
Tika turpināts darbs pie anti-HVR1 imūnas atbildes novērtēšanas. Tika veikta eksperimentu sērija, lai noteiktu visefektīvākās imunumogēnus. Tika izanalizēta peļu serumu sērija, kas tika iegūta no ar HCV HVR1 sekvenču saturošiem VLP imunizētiem dzīvniekiem. (eksperimenta tika izmantotas gan HVR1 sekvences iegūtas no Latvijas pacientiem gan literatūrā atrastas HVR1 sekvences ar augsto krustreaktivitātes potenciālu). Eksperimentu gaitā tika noteiktas HVR1 sekvences, kas imunizācijas rezultātā izraisa neitralizējošas anti-HCV antivielas rāšanas gan ar augsto titru, gan ar augstam anti-HCV krustreakcijas spējam.
1.4. Perspektīvāko vakcīnu kandidāta izvēle.
Apkopojot un izanalizējot iegūtos datus tika izvēlētas perspektīvas konstrukcijas un imunizācijas shēmas, kas var kļūt par pamatu vakcīnu prototipiem. Iegūta informācijas tika izmantota patenta pieteikuma sagatavošanai.
Līdz 30.09.2013.
1.1 Proteīnu un DNS vakcīnu komponentu iegūšana un raksturošana.
Tika pilnveidota rekombinanto cilvēka hepatīta B vīrusa kora antigēna (HBc) platformas uzkonstruēto vīrusveidīgo daļiņu iegūšanas tehnoloģija. Tika optimizēti rekombinanto proteīnu ekspresejošo E.coli šūnu kultivēšanas apstākļi, kā arī rekombinanto proteīnu attīrīšanas metodes.
1.2. Dzīvnieku imunizācija.
HCV NS3 1435-1446 as CTL epitopu un HVR1 sekvenci saturošas himerās VLD uz dabīgā un modificētā HBcAg bāzes tika izmantotas C57BL/6 peļu imunizācijai. Dzīvnieku modelis un imunizācijas shēma tika piemeklēti lai iegūtu gan B-, gan T- šūnu imunoloģisko atbildi.
1.3. B- un T- šūnu imūnā atbilde.
No ar HCV NS3 1435-1446 as CTL epitopu un HVR1 sekvenci saturošām himerām VLD imunizētam pelēm tika savākti asins seruma un liesas paraugi imunoloģiskas atbildes noteikšanai.
Tika konstatēts, kā imunizēto dzīvnieku asins serums satur gan anti-HBc, gan anti-HVR1 antivielas. Tika paradīts, ka abos gadījumos antivielu titrs ir pietekoši augsts. Imunizēto peļu asins serumu paraugi tika pārbaudīti HCV pseudotyping neitralizācijas eksperimentos. Tika konstatēts, kā HCV neitralizējušām antivielām serumā piemīt augsti specifiskā aktivitāte pret imunizācijai izmantoto HVR1 sekvenci.
Imunizēto dzīvnieku liesas paraugi tika pārbaudīti proliferācijas eksperimentos. Tika paradīts, ka imunizētiem dzīvniekiem aktivizējas gan anti-HBc, gan anti-NS3 specifiskie citotoksiskie limfocīti.
1.4. Perspektīvāko vakcīnu kandidāta izvēle.
Apkopojot un izanalizējot iegūtos datus tika izvēlētas perspektīvas konstrukcijas un imunizācijas shēmas, kas var kļūt par pamatu vakcīnu prototipiem. Iegūta informācijas tika izmantota patenta pieteikuma sagatavošanai.